磺胺甲恶唑快速检测试剂盒
本试剂盒仅供研究使用
产品编号：CSB-E12084f
检测范围：0.156-10 ng/ml
最低检测限：蜜蜂0.05 ng/ml；血清0.2ng/ml；肌肉/肝脏、鸡蛋0.1ng/ml；鱼虾0.1ng/ml；牛奶1 ng/ml
特异性：本试剂盒可用于快速检测样本中残留的磺胺甲恶唑。
有效期：6个月
预期应用：ELISA法定量测定动物组织（肌肉/肝脏）、鸡蛋、牛奶、血清及鱼、虾、蟹等水产品中的磺胺甲恶唑残留。
回收率：
牛奶 | 99.0% |
肉 | 101.5% |
鸡蛋 | 94.9% |
蜜蜂 | 92.1% |
鱼 | 95.6% |
虾 | 98.9% |
交叉反应率：
磺胺喹恶啉 | 100% |
磺胺甲嘧啶 | 3.2% |
磺胺甲基嘧啶 | 1.1% |
磺胺甲氧吡嗪 | 0.9% |
磺胺间甲氧嘧啶 | 0.8% |
磺胺塞唑 | 0.55% |
磺胺嘧啶 | 0.2% |
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
实验原理
本试剂盒应用竞争抑制酶标免疫分析法测定标本中待测物质水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，
往包被抗体的微孔中同时加入酶标的抗原和待测抗原，被测抗原与酶标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。经过彻
底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓
度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量呈
负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 已包被兔抗磺胺甲恶唑抗体的酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）：2×250ul/瓶。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)：2×20ml/瓶。
4. 辣根过氧化物酶标记磺胺甲恶唑结合物（HRP-Sulfamethoxazole）：1×100ul/瓶（1：100）。
5. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
6. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
7. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 超声清洗器
5. 氮气吹干仪
6. 干净的试管和Eppendof管
7. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
8. 蒸馏水，容量瓶等
样本预处理：
1. 肌肉、肝脏等动物组织及鸡蛋
用搅拌器将样本搅拌均匀；取2.0g左右的均质物至50ml离心管中，立即加入8 ml乙腈，振荡20 min， 3000g以
上离心5 min；取2.5 ml上清液至10 ml玻璃试管中，于50~60℃水浴氮气下吹干；加入1 ml正己烷，溶解干燥残留
物然后加入1 ml 0.02M PBS缓冲液，旋涡1min，在3000g以上离心10min；除去上层正己烷相，取50ul下层水相
用于分析。
2. 鱼、虾等动物组织
用搅拌器将样本搅拌均匀；取2.0g左右的均质物至50ml离心管中，加入2ml去离子水，搅拌至糊状；加入8 ml乙腈，
立即振荡20 min，3000g以上离心5 min；取2.5ml上清液至10ml玻璃试管中，于50~60℃水浴氮气下吹干；加入
1 ml正己烷溶解干燥残留物，然后加入1 ml 0.02M PBS缓冲液，旋涡1min，在3000g以上离心10min；除去上层
正己烷相，取50ul下层水相用于分析。
3. 血清样本
将样本于室温放置30min，3000g以上，10℃离心10min，分离出血清或过滤血清；取1ml至10ml试管中，加入3ml
0.02M PBS溶液混合均匀；取50ul用于分析。
4. 蜜蜂样本
取1.0g左右蜜蜂样本至50ml离心管中，加入2ml0.02MPBS缓冲液溶解；加入8ml乙酸乙酯，振荡10min，3000g
以上离心10min；取4ml上清至10ml玻璃管中，于50~60℃水浴氮气下吹干，加0.5ml0.02M PBS缓冲液溶解；取
50ul用于分析。
5. 牛奶
将样本于10℃、3000g以上离心10min，吸去上层脂肪；取1ml离心后的样本，用0.02M PBS缓冲液按1:19的比例
进行稀释；取50ul用于分析。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果
才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶浓度为10 ng/ml，以样品稀释液做系列倍比稀释，分别稀释10ng/ml，5ng/ml，
2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312ng/ml，0.156ng/ml。样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做
标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50ul，余孔分别加标准品或待测样品50ul，注
意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul酶标物。尽量不触及孔壁，轻轻晃动
混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，250ul/每孔，甩干。
3. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的后3-4孔有明显的梯度蓝色，前3-4孔
颜色不明显，即可终止）。
4. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
5. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、辣根过氧化物酶标记磺胺甲恶唑结合物工作液请依据所需的量
配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、辣根过氧化物酶标记磺胺甲恶唑结合物工作液。
5.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将
推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值
由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
9. 本产品适用于大量样本的快速筛查。由于生物试验存在人为及不可预知的影响因素，本试剂盒得到的检测结果仅为参考，
不能据此做出任何结论。本公司不承担由此引起的任何责任。
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