三聚氰胺（Melamine）ELISA快速检测试剂盒
使用说明书
本试剂盒仅供研究使用
产品编号：CSB-E12003f
检测范围：7.8-500 ng/ml
最低检测限：1 ng/ml
特异性：本试剂盒可用于快速检测三聚氰胺, 与三聚氰酸有一定的交叉反应。
有效期：6 个月
预期应用：ELISA 法定量测定食品原料、奶制品、婴儿食品、含奶粉成分的食品、宠物食
品及饲料等样品中三聚氰胺的含量。
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造
成任何影响。
概述
三聚氰胺(Melamine)（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为[1,3,5-三
嗪-2,4,6-三氨基]，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，
几乎无味，微溶于水(3.1 g/L常温)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，
对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。
食品工业中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所
以常用一种叫做凯氏定氮法的方法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含
量。由于三聚氰胺（含氮量66%）与蛋白质（平均含氮量16%）相比含有更高比例的氮原
子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象，从而造成诸
如2007 年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件等严重的食物安全事故。有鉴于
此，三聚氰胺含量检测是目前国内食品安全检测的焦点。
中国国家食品质量监督检测中心在2008 年9 月13 日指出，三聚氰胺属于化工原料，是
不允许添加到食品中的，故暂未设定像农药般的残留标准限制。10 月8 日，卫生部、工业
和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，
制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为
1mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。液态奶（包括原料乳）、奶粉、其它配方乳粉中
三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。含乳15%以上的其它食
品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。
实验原理
本试剂盒应用竞争抑制酶标免疫分析法测定标本中待测物质水平。用纯化的抗体包被微
孔板，制成固相抗体，往包被抗体的微孔中同时加入酶标的抗原和待测抗原，被测抗原与酶
标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化
物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗
原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物
质含量呈负相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 已包被兔抗三聚氰胺抗体的酶联板(Assay plate)：一块（96孔）。
2.标准品（Standard）：2×250ul/瓶（500 ng/ml）。
3. 样品稀释液(SampleDiluent)：2×20ml/瓶。
4.辣根过氧化物酶标记三聚氰胺结合物（HRP-Melamine）：1×60ul/瓶（1：100）。
5. 底物溶液（TMBSubstrate）：1×10ml/瓶。
6. 浓洗涤液（WashBuffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。
7. 终止液（StopSolution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 超声清洗器
5. 离子交换小柱（PCX）
6. 氮气吹干仪
7. 干净的试管和Eppendof 管
8. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
9. 蒸馏水，容量瓶等
样品处理方法：
1. 样品标准处理方法
(1) 提取：称取样品5 g，加入50 ml 0.1%的三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2 ml2%
乙酸铅溶液；超声处理20 分钟。将溶液转移至10 ml 离心管中，8000 rpm/min离心10 分钟，
然后取上清液3 ml 过混合型阳离子交换柱（PCX）。
(2) 净化（PCX 小柱，60 mg/ml）：
活化及平衡：3 ml 甲醇，3 ml 水。
上样：3 ml 提取液。
淋洗：3 ml 水；3 ml 甲醇；弃去淋洗液并将小柱抽干。
洗脱：5 ml 5%氨化甲醇洗脱。
浓缩：50℃，氮气吹干。然后用样品稀释液稀释至所需浓度。
2. 样品快速处理方法（推荐）：取1 g 样品，加入10 ml 甲醇充分混合。5000 g以上离心10
分钟。取上清1 ml 于试管中，用氮气吹干。加入2.5 ml 10%甲醇/20 mM PBS溶液充分
溶解，取150 uL 用于分析。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准
曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度
时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2 瓶，每瓶浓度为500ng/ml，以样品稀释液做系列倍比稀释，分别稀
释500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2ng/ml，15.6 ng/ml，7.8ng/ml。_______样品
稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试
剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加
标准品或待测样品50ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，然后在标准
孔、待测样品孔中加入50 ul 稀释好的酶标物工作液。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60 分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。
3. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的后3-4
孔有明显的梯度蓝色，前3-4 孔梯度不明显，即可终止）。
4. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量
与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入
终止液。
5. 用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值）。在加终止液后15分钟以内
进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、辣根过氧化物酶标记三聚氰胺结
合物工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、辣根过氧化物
酶标记三聚氰胺结合物工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，
酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml 注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需
要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘
出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物
的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样
品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
9. 本产品适用于大量样本的快速筛查。由于生物试验存在人为及不可预知的影响因素，本
试剂盒得到的检测结果仅为参考，不能据此做出任何结论。本公司不承担由此引起的任何责
任。
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