呋喃它酮代谢物(AMOZ)酶联免疫检测
本试剂盒仅供研究使用
产品编号：CSB-E12039f
最低检测限：本试剂盒对各种组织的最低检测限为0.1ng/ml，平均回收率为75％～105％，板内、板间变异系数均小于
10％，标准曲线如图1所示。
特异性：本试剂盒可用于快速检测AMOZ，与其它化合物无明显交叉反应。
有效期：6个月
预期应用：本试剂盒可以快速检测猪、鸡、鱼、虾、蟹组织和牛奶、蜂蜜中的AMOZ残留，适合在畜禽、水产养殖场、
加工厂、内外贸易口岸、集贸市场以及药物残留监控部门使用。
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
概述
硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为猪、
禽类和水产促生长的添加剂。但研究发现，硝基呋喃类的药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变。1995年，
呋喃它酮被欧洲禁止用于治疗和饲料中。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存
留较长的一段时间，所以在分析呋喃它酮的残留时经常要分析其代谢后的产物AMOZ。通常是用LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS
法来检测呋喃它酮，但这需要特殊设备和一定的技术要求，且时间相对较长。而酶联免疫方法则利用AMOZ的特异性抗体，
同时结合色谱技术来检测呋喃它酮代谢物含量。具有高精确度，反应灵敏，技术要求不高和检测时间短等优点。我公司自主
研发的呋喃它酮快速检测试剂盒利用竞争抑制酶标免疫分析法，来检测动物组织（肉、肝脏）、蜂蜜和鱼虾等样本中的呋喃
它酮药物残留。
实验原理
本试剂盒应用竞争抑制酶标免疫分析法测定标本中待测物质水平。在酶标板微孔中同时加入标准品或样品溶液、AMOZ
特异性抗体工作液和酶标抗体工作液，游离的AMOZ与包被在酶标板上的AMOZ竞争特异性抗体结合位点，同时特异性抗体与
酶标抗体结合。经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量
呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）：2×100µl/瓶（8ng/ml）。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。
4. 辣根过氧化物酶标记AMOZ结合物（HRP-AMOZ）：1×100µl/瓶（1：100）。
5. 辣根过氧化物酶标记AMOZ结合物稀释液（HRP-AMOZ Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
7. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
8. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 超声清洗器
4. 氮气吹干仪
5. 干净的试管和Eppendof管
6. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
7. 蒸馏水，容量瓶等
样品处理方法：
1. 称取2g均质组织于50ml塑料离心管中，加入4.5ml蒸馏水、0.5ml 1mol/LHCl和100µl辅助提取剂，混匀静置10min；
2. 加入5ml样品稀释液、0.4ml 1MNaOH混合均匀，5000 r/min离心5min；
3. 将8ml上清液转入新的离心管，加入8ml乙酸乙酯，剧烈振荡后5000r/min离心5min；
4. 将5ml上清转入另一离心管50℃水浴氮气吹干，加入1ml样本稀释液，漩涡15秒，调pH7.4，取150µl用于分析。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才
是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶浓度为8 ng/ml，以样品稀释液做系列倍比稀释，分别稀释8 ng/ml，4 ng/ml，2ng/ml，
1 ng/ml，0.5 ng/ml，0.25 ng/ml，0.125 ng/ml。样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。
如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100µl，余孔分别加标准品或待测样品100µl，注意
不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，然后在所有孔中加入50µl酶标物。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶
标板加上盖或覆膜，37℃反应40 min。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350µl/每孔，甩干。
3. 依序每孔加底物溶液90µl，37℃避光显色（15min内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯
度不明显，即可终止）。
4. 依序每孔加终止溶液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为
了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
5. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15min以内进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、辣根过氧化物酶标记AMOZ结合物工作液请依据所需的量配置使
用。请勿重复使用已稀释过的标准品、辣根过氧化物酶标记AMOZ结合物工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推
荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
计算每个标准品和样品的平均吸光度，除以零标准的平均吸光度就得到结合率。将结合率输入到半对数系统中，对应
于各自的AMOZ标准的浓度就可以获得一个标准曲线。用样品的结合率对照标准曲线就可以找到对应的AMOZ浓度。再乘以
稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
9. 本产品适用于大量样本的快速筛查。由于生物试验存在人为及不可预知的影响因素，本试剂盒得到的检测结果仅为参考，
不能据此做出任何结论。本公司不承担由此引起的任何责任。
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