WakoPURE system
新一代体外蛋白质合成系统
WakoPURE system采用世界首创的再构成系无细胞蛋白质合成技术,对于复制、翻译及能量再生所需要的约30种因子进行调制、精制后,再加以重新构成。其中包括大肠菌的翻译因子--开始因子(IF1、IF2及IF3)、伸长因长(EF-G、EF-Tu及EF-Ts)、终结因子(RF1、RF2及RF3)、脂质体循环因子、与20种氨基酸相对应的氨基酰tRNA合成酶、甲硫氨酸酰胺tRNA转移酶、T7 RNA聚合酶等。此外,还包括脂质体、氨基酸、tRNA、能量源及能量再生系统。
对于上述构成因子(脂质体蛋白质除外),均添加了组氨酸标签。通过使用金属新和树脂,使反应所需的因子与目标蛋白质之外的构成因子相结合,再通过限外过滤即可除去树脂结合因子与脂质体蛋白质。采用这种方法,可以在短时间内得到高纯度、无标签的目标蛋白质。
【特点】
● 通过逆反应用标签系统,使蛋白质的精制变得更容易。
●使天然序列蛋白质的精制更容易。
● 由于是重组系,因此不含有杂质蛋白质。
●从合成到精制结束只需要三个小时。
● RNase污染极少。
【扩大反应规模】
采用WakoPURE system,可以根据需要扩大反应规模。单个产品为50μl。如使用多个产品,则可以实现蛋白质的大量合成。增加反应液并不会影响合成效率。
使用试剂盒中的二氢叶酸还原酶(DHFR)对照剂,在37°C条件下进行DHFR合成反应一小时后,对每一道使用5μl。然后进行SDS-PAGE,最后用SYPRO RED进行染色。
【Q&A】
Q.所用的模板需要什么条件?
A.WakoPUREsystem可用于PCR产物或者质粒。但是,模板需要具备下列序列
(亦可以是RNA)。
·开始密码子:(ATG)
·终止密码子:(TAG、TGA或TAA三者之一)
·在基因上流应有T7操纵子序列
·在开始密码子的上流约10个碱基处应有脂质体结合部位(SD序列)
·在终止密码子的下流应有6个碱基以上的序列(适用于PCR产物)
·在终止密码子的下流应有复制终止子序列(适用于质粒DNA)
Q.蛋白质合成量有多少?
A.最大获取量为100μg/ml。平均合成量为20~50μg。
编号 | 品名 | 容量 |
299-59501 | WakoPURE System
（体外蛋白质合成试剂盒） | 4次用 |
295-59503 | 16次用 |
<</span>四次用试剂盒>
A溶液 ..................................25μl×4支
B溶液 ..................................10μl×4支
DHFR对照剂 ............................ 5μl×1支
通用启发剂..............................80μl×1支
手册
<</span>十六次用试剂盒>
A溶液 ..................................25μl×16支
B溶液 ..................................10μl×16支
DHFR对照剂 .......................... 5μl×1支
通用启发剂............................. 80μl×1支
手册
用于蛋白质组研究的
高纯度基质
在蛋白质组分析中,经常会使用质谱仪来进行蛋白质的鉴定及翻译后的修饰。根据电离方法及分析仪的不同组合,质谱仪可以分为多种类型。在测定肽的质谱时,通常会采用MALDI法(Matrix-assisted Laser DesorptionIonization,即基质辅助激光解附电离法)及ESI法(ElectrosprayIonization,即电喷雾电离质谱法)。MALDI法的长处在于可以在短时间内对于多种样品进行处理,而在使用串联质谱仪获取肽的序列信息时,则可以采用ESI法。MLADI法是将样本添加在一种被称为基质(matrix)的化合物上,制成混合结晶,然后再用激光照射其表面以实现离子化。用作基质的化合物可以是α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamicAcid)、芥子酸(SinapicAcid,SA)或者2,5-二羟基苯甲酸(2,5-Dihydroxybenzoic Acid,DHB)。根据样本的不同,可选用不同的基质。一般说来,CHCA适用于肽类样品,SA适用于蛋白质样品,而DHB则适用于肽、糖类及糖脂类样品。但是,对于市面上出售的基质产品,如果不进行任何处理而加以使用,则在质谱分析数
据上会出现来源于基质的峰值,本底较高,信噪比较小。因此,对于这些基质,在使用前应进行再结晶处理,以尽可能除去源自基质的峰质。
本品为一种经过再结晶处理的高纯度基质。使用时无须进行再结晶处理即可得到清晰的质谱。
CHCA再结晶处理的效果
基质的质谱
图1-a:未经处理的CHCA
图1-b:经再结晶处理的CHCA CHCA再结晶处理的效果
日本和光对于市面上出售的CHCA以及经再结晶处理的CHCA的MALDITOFMS数据进行了比较。图1所示为基质的质谱。图2为对于基质与肽样品的混合结晶使用激光照射后所得到的质谱。可以看到,再结晶高纯度CHCA的质谱具有较少的背景噪声,因此更加清晰。(数据提供:大阪府立母子保健综合医疗中心和田芳直先生)。
测定肽样品的质谱
图2-a:未经处理的CHCA
图2-b:经结晶处理的CHC
编号 | 品名 | 用途 | 容量 |
037-19261 | α-氰基-4-羟基肉桂酸 [CHCA] | 蛋白质组分析用 | 50mg×5支 |
192-13361 | 芥子酸 [SA] | 蛋白质组分析用 | 50mg×5支 |
044-29101 | 2,5-二羟基苯甲酸 [DHB] | 蛋白质组分析用 | 50mg×5支 |
编号 | 品名 | 用途 | 容量 |
125-05061 | 赖氨酰肽链内切酶，质谱分析级 | 蛋白质组分析用 | 20μg×5支 |
202-15951 | 猪胰岛素，质谱分析级 | 蛋白质组分析用 | 20μg×5支 |
293-57701 | 阴性胶片染色剂质谱分析套装 | 电泳分析用 | 20次 |
299-58901 | 银染试剂质谱分析套装 | 电泳分析用 | 20次 |